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                    RNase污染預(yù)防指南
                    瀏覽次數(shù):6579發(fā)布日期:2014-12-10

                    在開始RT-PCR定量檢測之前,請(qǐng)閱讀關(guān)于PCR的實(shí)驗(yàn)方案和操作建議。RNA的純度和完整性是合成全長cDNA的關(guān)鍵。RNA的質(zhì)量受RNase A的影響,RNase A是一般實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中存在的非常穩(wěn)定的污染物。因此,從事RNA研究時(shí),需要時(shí)刻考慮到RNase污染的問題。所有Thermo Scientific應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的產(chǎn)品(包括酶、緩沖液、水、核苷酸和寡核苷酸)經(jīng)嚴(yán)格測試均不含RNase污染。 為防止污染這些高質(zhì)量的組分,實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和所有自制溶液也必須無RNase污染。

                    避免RNase污染的常規(guī)操作建議:
                    • 用DEPC處理所有在cDNA合成中將要使用的試管和槍頭,或使用經(jīng)過認(rèn)證的無RNase的實(shí)驗(yàn)室器具。
                    • 使用RNA工作的移液器。
                    • 操作RNA和所有試劑時(shí)需佩戴手套,因?yàn)槠つw是RNase的主要來源。經(jīng)常更換手套。
                    • 使用鑒定合格的試劑,包括高質(zhì)量的水(如DEPC-treated water)。
                    • 使用RNase抑制劑來穩(wěn)定RNA,例如RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381)。
                    • 進(jìn)行cDNA合成前,要求對(duì)RNA的完整性進(jìn)行鑒定。
                    • 例如,如果在總RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳中,人的18S rRNA(分子量約1.9kb)和28S rRNA(分子量約為5kb)都形成了非常窄的條帶,則認(rèn)為該樣品中的mRNA是完整無缺的。

                    RT反應(yīng)混合物的組分
                    模板RNA
                           標(biāo)準(zhǔn)方法分離的細(xì)胞總RNA,可與Thermo Scientific逆轉(zhuǎn)錄酶或*鏈cDNA合成試劑盒一起成功使用。純化的RNA要求無鹽、金屬離子、乙醇和酚殘留,以避免在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)期間
                    產(chǎn)生抑制作用。另外,RT-PCR的模板RNA必需無DNA污染,以避免PCR或qPCR出現(xiàn)假陽性結(jié)果。推薦使用DNase I,RNasefree(#EN0521)除去制備的RNA中痕量的DNA殘留。設(shè)置RT-PCR對(duì)照反應(yīng),對(duì)照組中模板是未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的RNA。

                    從制備的RNA中除去基因組DNA:
                    1. 在RNase-free的試管中加入以下組分:
                     

                    RNA1-2 μg
                    10x reaction buffer with MgCl21 μl
                    DNase I, RNase-free (#EN0521)1-2 μl (1-2 U)
                    DEPC-treated Waterto 9 μl
                    Total volume10 μl


                    2. 37℃孵育30分鐘。
                    3. 加入1μl 50mM EDTA后,65℃孵育10分鐘。無螯合劑存在時(shí)加熱將促使RNA水解2。或者使用酚/氯仿抽提RNA。
                    4. 所制備的RNA可用作逆轉(zhuǎn)錄的模板。

                    備注:
                    • 每μg RNA,不要使用超過1U的DNase。
                    • 如果有大量RNA,可以將反應(yīng)體系放大。
                    • 推薦的RNAzui終濃度為0.1-0.2 μg/μl。
                    • RiboLock RNase Inhibitor(#EO0381)也可以加入到反應(yīng)體系中,抑制可能存在于起始RNA溶液中的RNase A。推薦使用濃度為1U/μl。

                    引物
                            oligo(dT)18、隨機(jī)引物或基因特異性引物均可用于*鏈cDNA的合成。Oligo(dT)18引物從真核mRNA 3’-末端的Poly(A)尾開始合成cDNA。而隨機(jī)引物,如六聚體引物,可以從所有類型RNA(rRNA和mRNA)開始進(jìn)行cDNA合成。因此,使用隨機(jī)引物合成的cDNA比使用Oligo(dT)18引物合成的cDNA更加復(fù)雜,可能降低接下來PCR反應(yīng)的靈敏度和/或特異性。然而,隨機(jī)引物可以優(yōu)先應(yīng)用于以下幾種情況:使用無poly(A)尾的真核生物mRNA進(jìn)行cDNA合成,或使用富含poly(A)的RNA模板進(jìn)行cDNA合成,以及進(jìn)行長片段mRNAs 5’-區(qū)域的RT-PCR。基因特異性引物為cDNA合成提供了zui高的特異性,引物由用戶自己制備。

                    逆轉(zhuǎn)錄酶
                           所有的Thermo Scientific 逆轉(zhuǎn)錄酶均適用于全長*鏈cDNA合成,但逆轉(zhuǎn)錄酶在反應(yīng)溫度、可轉(zhuǎn)錄的RNA量、靈敏度和RNase H活性方面有所不同。每種酶推薦使用的反應(yīng)條件請(qǐng)
                    參見《使用RNA作為起始材料:用于RT-PCR和RT-qPCR的Thermo Scientific解決方案

                    *鏈cDNA的合成
                    下面列出了使用RevertAid H Minus Reverse Transcriptase進(jìn)行*鏈cDNA合成的實(shí)驗(yàn)方案。使用其它種類逆轉(zhuǎn)錄酶的相應(yīng)反應(yīng)條件,請(qǐng)參見第56頁的逆轉(zhuǎn)錄酶選擇表。Master Mix
                    為了準(zhǔn)備多個(gè)平行實(shí)驗(yàn)并zui大程度減少加樣誤差和污染,先將除了RNA和引物之外的所有反應(yīng)組分預(yù)先混合制備RT master mix。制備足量的master mix(足夠用于所需反應(yīng)并多配制一份以補(bǔ)償加樣誤差)。將模板RNA加入到各個(gè)試管中,并置于冰上。將所制備的master mix等分加入含有RNA的試管中。各組分自冷藏取出后,融化混勻并短暫離心,冰浴放置。

                    1. 按以下順序在無菌、nuclease-free的試管(冰浴放置)中加入以下組分:
                     

                    模板 RNA總 RNA
                    或 poly(A) RNA
                    或特異性 RNA
                    0.1 ng - 5 μg
                    10-500 ng
                    0.01 pg - 0.5 μg
                    引物Oligo(dT)18 引物 (#SO131)
                    或隨機(jī)六聚體引物 (#SO142)
                    或基因特異性引物
                    0.5 μg (100 pmol)
                    0.2 μg (100 pmol)
                    15-20 pmol
                    DEPC-treated Water (#R0601)to 12.5 μl
                    總體積12.5 μl


                    2. 任選:如果RNA模板GC含量高,或含有二級(jí)結(jié)構(gòu),則需要輕輕混勻,短暫離心,65℃孵育5分鐘后在冰上急冷,短暫離心后冰浴放置。
                    3. 按順序添加下述組分,或制備master mix:
                     

                    5x 反應(yīng)緩沖液4 μl
                    RiboLock RNase Inhibitor (#EO0381)0.5 μl (20 U)
                    dNTP Mix, 10 mM each (#R0191)2 μl (1 mM終濃度)
                    RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (#EP0451)1 μl (200 U)
                    總體積20 μl


                    4. 輕輕混勻并短暫離心。
                    5. 如果引物為 oligo(dT)18 或基因特異性引物,反應(yīng)條件為42℃孵育60分鐘。如果使用隨機(jī)六聚體引物,則在25℃孵育10分鐘后,再在42℃孵育60分鐘。對(duì)于GC含量高的RNA的轉(zhuǎn)
                    錄實(shí)驗(yàn),可將反應(yīng)溫度升高到45℃。
                    6. 反應(yīng)液70℃加熱5分鐘以終止反應(yīng)。

                    備注
                    • 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品可直接用于PCR中,或在-20℃下儲(chǔ)存。
                    • 在50μl PCR反應(yīng)體系中,使用2μl 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物。

                    qPCR優(yōu)化指南

                     

                    優(yōu)化參數(shù)建議
                    qPCR 板建議使用不透明的白色PCR板進(jìn)行qPCR檢測。這種白顏色實(shí)質(zhì)上消除了孔與孔之間的串聯(lián)干擾,并提高了熒光探測的效率,從而增加了定量檢測的靈敏度以及孔與孔之間的一致性。
                    模板質(zhì)量qPCR檢測中使用的核酸要求具有足夠的純度。模板污染(如基因組DNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物或有機(jī)溶劑)會(huì)對(duì)定量檢測的可靠性和可重復(fù)性產(chǎn)生巨大影響。模板質(zhì)量必須通過分光光度儀(如Thermo Scientific Nanodrop)、微流體或PAGE進(jìn)行檢測。
                    擴(kuò)增子長度擴(kuò)增子長度理想情況下,擴(kuò)增子長度應(yīng)在100bp至150bp之間,以確保qPCR反應(yīng)效率盡可能接近100%。好的qPCR效率可以促進(jìn)定量檢測的可重復(fù)性和靈敏度。對(duì)于特定試劑,遵守其使用說明中關(guān)于擴(kuò)增子長度的要求。
                    SYBR Green法
                    的引物設(shè)計(jì)
                    鑒于PCR引物是qPCR定量檢測中成本相對(duì)較低的一種組分,對(duì)于每一種新的qPCR定量檢測試劑,推薦訂購和測試至少兩對(duì)引物,增加建立可靠的、可重復(fù)的、靈敏的定量檢測方法的機(jī)會(huì)。
                    測試引物使用SYBR Green法對(duì)一系列梯度稀釋的模板進(jìn)行檢測,以確認(rèn)qPCR定量檢測方法的重復(fù)性、特異性、靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍。理想情況下,qPCR反應(yīng)的效率應(yīng)高于90%,低于105%,而定量檢測的可重復(fù)性應(yīng)高于r=0.998。
                    有效的RT實(shí)驗(yàn)初始階段應(yīng)根據(jù)供應(yīng)商說明書中的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn),但RT步驟的用時(shí)和溫度可以進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化以提高逆轉(zhuǎn)錄酶的效率。應(yīng)在一系列RNA濃度范圍上對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行測試,以確保定量檢測的線性度。
                    熱啟動(dòng)qPCR方案包括在95℃加熱的步驟,以確保熱啟動(dòng)DNA聚合酶被*激活。必須遵守試劑的使用說明。加熱步驟時(shí)間太短會(huì)影響定量檢測的重復(fù)性和靈敏度。
                    循環(huán)方案循環(huán)方案即便您曾經(jīng)使用其他供應(yīng)商的混合試劑對(duì)您的定量檢測方法進(jìn)行過優(yōu)化,我們?nèi)匀唤ㄗh使用Thermo Scientific qPCR master mix使用指南中推薦的熱循環(huán)方案。如果需要進(jìn)行定量檢測方法優(yōu)化,應(yīng)該首先檢查退火溫度。
                    退火溫度測試一系列的退火溫度。根據(jù)qPCR結(jié)果,應(yīng)以2-3℃為單位升高或降低退火溫度。此操作可通過設(shè)定thermal gradient在一個(gè)簡單的實(shí)驗(yàn)中完成。也可以使用多個(gè)qPCR實(shí)驗(yàn)來測試一系列的退火溫度。
                    引物濃度一般使用在master mix中推薦的引物濃度來進(jìn)行qPCR反應(yīng)。如果需要優(yōu)化,嘗試以25mM為單位升高或降低引物濃度。
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